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人外周血造血干細胞分離液說(shuō)明書(shū)
點(diǎn)擊次數:2732 更新時(shí)間:2016-04-22

LGS1068人外周血造血干細胞分離液說(shuō)明書(shū)

人外周血造血干細胞分離液說(shuō)明書(shū)
【產(chǎn)品規格】
200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶(hù)使用,試劑內容如下:

 

名稱(chēng)

產(chǎn)品規格

編號

A

人外周血干細胞細胞分離液

 

200ml

B

樣本稀釋液(贈品)

2010C1119

200ml

C

清洗液(贈品)

2010X1118

200ml

D

說(shuō)明書(shū)

 

1


【實(shí)驗前準備】
A.適用儀器
zui大離心力可達 1200g的水平轉子離心機
B.耗材

產(chǎn)品名稱(chēng)

產(chǎn)品貨號

產(chǎn)地

15ml離心管散裝

339650

美國  NUNC

15ml離心管架裝

339651

美國  NUNC

50ml離心管散裝

339652

美國  NUNC

50ml離心管架裝

339653

美國  NUNC

無(wú)菌膠頭滴管或塑料滴管

 

 


【檢驗方法】
全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗環(huán)境均需在 20±2的條件下進(jìn)行。
首先取抗凝血按體積比 1:1的比例加樣本稀釋液(產(chǎn)品編號:2010C1119)混勻,
根據稀釋后的樣本量大小,分以下兩種情況:
情況 A:稀釋后的血液樣本量小于5ml 時(shí),實(shí)驗方法如下:
1.取一支15ml離心管,先加入與稀釋后樣本等量的分離液(注:分離液zui少不得少于  3ml)。
2.用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液液面上,400-500g,離心20-30min(注:
根據血液樣本量確定離心條件,血液樣本量越多,離心力越大,離心時(shí)間越長(cháng),具體離
心條件需客戶(hù)自行摸索,以達到分離效果)。
 3.離心后,此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色目的

細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。
4.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色目的細胞層到另一 15ml離心管中,往所得離心管中
加入 10ml清洗液(產(chǎn)品編號:2010X1118),混勻細胞。
5. 250g,離心 10min。
6.棄上清。
7.用吸管以5ml清洗液(產(chǎn)品編號:2010X1118)重懸所得細胞。
8. 250g,離心 10min。
9.重復  6、7、8,棄上清后以 0.5ml后續實(shí)驗所需相應液體重懸細胞。
10.差異貼壁法純化細胞
1)用干細胞無(wú)血清培養基或干細胞*培養基以 1.5-3×10 6個(gè)/ml的密度重懸細胞,將細胞鋪于一次性細胞板或細胞瓶中,放于 37二氧化碳培養箱中進(jìn)行貼壁培養。
22-4小時(shí)內貼壁的為巨噬細胞前體(俗稱(chēng)為單核細胞)。
310-24小時(shí)內貼壁的單個(gè)核細胞為內皮、內皮祖細胞、干細胞。
4)不貼壁的為淋巴細胞。
注:
a)
無(wú)血清培養基中不含任何動(dòng)物成分,為得到更佳培養效果可添加10%自體血漿或
2-8% 經(jīng)篩選的胎牛血清。
b)
c)
*培養基中含 2-20% 胎牛血清(血清具體含量由所培養的目的細胞而定)。
由于每種細胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細胞分開(kāi)已達簡(jiǎn)單的純化目的,此法成
本相對較低。如需獲得高純度目的細胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽(yáng)性或陰
性分選。
情況 B:稀釋后的血液樣本量大于等于 5ml時(shí),實(shí)驗方法如下:
1.取一支適當的離心管,先加入與稀釋后樣本等量的分離液。
2.將經(jīng)稀釋后的血液樣本小心加于分離液之液面上,450-650g(zui大離心力可至 1000g),
離心 20-30min。(注:根據血液樣本量確定離心條件,血液量越多,離心力越大,離心
時(shí)間越長(cháng),具體離心條件需客戶(hù)自行摸索,以達到分離效果。加入血液樣本后,樣
本及分離液總體積不得超過(guò)離心管總體積的三分之二)。
3.剩余步驟同情況  A”中步驟 3至步驟  10。
  【注意事項】

1.全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗環(huán)境均需在   20±2的條件下進(jìn)行。為獲得的實(shí)驗結果,
在取血 2h內進(jìn)行實(shí)驗,血液存放時(shí)間越長(cháng),細胞分離效果越差。血液放置超過(guò)   6h
后分離效果更差甚至不能達到分離目的。
2.本實(shí)驗不使用高聚合材質(zhì)(如聚苯乙烯)的塑料制品,應使用無(wú)靜電、低靜電離心
管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品,因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì )
變成毛面,影響細胞分離效果。
3.吸取過(guò)多的目的細胞層及分離液層會(huì )導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒
細胞數量增加。
4.吸取過(guò)多的目的細胞層上層溶液會(huì )導致血漿蛋白及血小板混雜。
5.分離液用量大于稀釋后的血液樣本時(shí),分離效果更佳。
6.如實(shí)驗后干細胞得率或活性過(guò)低,請以尋求幫助。
【儲存條件及有效期】
18-25保存,有效期 2年。本品易感染細菌,需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作,啟
封后置常溫保存。如 4保存,本分離液易出現白色結晶,影響分離效果。
【參考值(參考范圍)】
本實(shí)驗外周血干細胞提取率大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細胞的數量及比例,用戶(hù)可適當進(jìn)行參考。

【相關(guān)實(shí)驗技術(shù)方案】
1.所獲得干細胞的培養技術(shù)。
2.所獲得干細胞的核酸提取技術(shù)。
3.所獲得干細胞的鑒定方法
A.流式細胞技術(shù)
B.免疫組化技術(shù)
C.原位雜交技術(shù)
D.PCR技術(shù)

注:上述技術(shù)方案詳情請登陸本搜索細胞分離、
純化、擴增、鑒定及生物治療技術(shù)手冊,并在說(shuō)明書(shū)項目欄下下載使用。
【可能存在的問(wèn)題及解決方法】
1.由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示:

出現情況

出現原因

建議解決方案

離心后目的細胞存在于血漿層或稀釋液層

轉速過(guò)小或離心時(shí)間過(guò)短

適當增減轉速

離心后目的細胞存在于分離液中

轉速過(guò)大或離心時(shí)間過(guò)長(cháng)

適當增減轉速

離心后白環(huán)層彌散

細胞密度過(guò)大

調整細胞密度

離心后白環(huán)層太淺或看不見(jiàn)

細胞密度過(guò)小

調整細胞密度
 

2.本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心,其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地
區客戶(hù)可根據當地情況對離心條件進(jìn)行適當調整。建議對離心條件進(jìn)行調整時(shí),恒定離
心時(shí)間,對離心轉速進(jìn)行調整。
3.本分離液依照標準,全部使用藥用級原料,性能指標與國產(chǎn)同類(lèi)產(chǎn)品略有不同,可
能出現紅細胞沉降不*的情況,可以適當加大離心轉速。
注:在對離心條件進(jìn)行調整時(shí),離心轉速的加減以 50-100g為基數,直至達到分離效果,
離心力zui小不得小于 400g,zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min為準。

 

滬公網(wǎng)安備 31011802001676號

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