酶聯(lián)免疫測定(ELISA)標準化中存在的問(wèn)題
免疫測定標準化的難點(diǎn)在于蛋白的不均一性、基質(zhì)效應、交叉反應以及需要測定接近測定方法下限的濃度等,所測定的免疫反應性通常是在糖基化、降解和復合形式上有差異的蛋白同種型的混合體。
(一)基質(zhì)效應
免疫測定的基質(zhì)效應通常定義為干擾抗原和抗體間反應但與分析物本身無(wú)關(guān)的非特異
因素?;|(zhì)效應與測定模式和抗體選擇有較大關(guān)系,因此,其對不同免疫測定的影響方式也有所不同?;|(zhì)效應通常由蛋白、鹽、磷脂、補體、抗免疫球蛋白抗體(類(lèi)風(fēng)濕因子和人抗鼠抗體)、藥物和可能污染樣本的物質(zhì)引起。這些效應可通過(guò)仔細的實(shí)驗設計來(lái)減少,例如使用一定亞型的高親和力抗體或抗體片段、降低樣本對總測定體積的比例、在測定緩沖液中加入免疫球蛋白、理想的溫育溫度和較長(cháng)的溫育時(shí)間。免疫測定的校準物通常用類(lèi)似于樣本的基質(zhì)的緩沖液制備,基質(zhì)可為無(wú)分析物的人血清、無(wú)免疫學(xué)交叉反應抗原的動(dòng)物血清或蛋白含量類(lèi)似于樣本的人工緩沖液等。因為血清的成分各有不同,每批血清基質(zhì)的差異有可能會(huì )影響校準,因此以純蛋白溶液作為基質(zhì)較容易保持一致,但對于結合至血清蛋白的激索來(lái)說(shuō),除了人血清外,其他基質(zhì)不能使用。
血清和血漿中總蛋白和鹽的濃度相當穩定,但尿液中鹽濃度則變化較大,鹽濃度增加對抗原抗體間反應起一個(gè)抑制作用。如果樣本體積小于總反應體積的10%~15%,則蛋白的影響不明顯,但有時(shí)為提高測定的敏感性,常需一個(gè)較大的樣本體積。因此,要求參考方法具有低的測定下限,且樣本體積對總反應體積應小至足以排除大部分基質(zhì)效應。
樣本中的免疫球蛋白可通過(guò)與測定中所使用的特異抗體發(fā)生反應而影響測定結果。如自身免疫病患者常有可與抗體反應的類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)針對動(dòng)物免疫球蛋白的嗜異性天然抗體相當普遍,但一般情況下其濃度和親和力較低。自身抗體和嗜異性天然抗體的存在通常會(huì )引起假陽(yáng)性反應。這些干擾可通過(guò)加入足量的來(lái)自同一種系的免疫球蛋白而減小,也可在測定中使用抗體的Fab或(F‘ab)2片段替代完整抗體來(lái)減小干擾,但如果樣本含有針對試劑抗體的個(gè)體基因型(idiotype)抗體,則這種方法無(wú)效。這種情況下只有將免疫球蛋白從樣本中去除或使用一個(gè)依據另一個(gè)抗體的方法測定。
各種補體成分均能與抗體反應,從而干擾試劑抗體結合抗原及與次級抗體反應的能力,在雙夾心測定中可引起假陽(yáng)性,在競爭抑制試驗中引起假陽(yáng)性。小鼠IgG2,和IgG2,免疫球蛋白亞對補體的效應尤為敏感??赏ㄟ^(guò)加熱樣本或在反應緩沖液中加入螯合劑來(lái)排除補體的干擾,但加熱會(huì )影響很多的分析物,而螯合劑對諸如鍺螯合劑和酶等非放射性核索標記物有干擾,因此傾向于使用對補體效應不敏感的抗體或抗體片段建立測定方法。
有報道稱(chēng)磷脂在類(lèi)固醇測定中可干擾抗原的結合而引起結果的假增高,許多其他因子如血清分離膠中的成分、抗凝劑去垢劑、藥物、非酯化脂肪酸等對某些免疫測定也有干擾。
(二)抗原的不均一性和交叉反應性
蛋白激索顯然是不均一的,其在血液循環(huán)中除了有生物學(xué)活性形式外,還有前激索、片段和亞單位。富甲狀腺索(PTH)、ACTH及其前體、催乳索和促胃液索的大的形式以及生長(cháng)激索的拼接變異體等均可引起測定問(wèn)題。使用單克隆抗體的兩位點(diǎn)雙夾心測定大大改善測定的特異性,例如使用抗絨毛膜促性腺激索的。和P亞單位的單抗建立的雙夾心方法將不會(huì )測定游離的亞單位。使用針對ACTH或PTH的氨基和羧基末端部分的兩個(gè)抗體建立的雙夾心方法則不會(huì )測定無(wú)生物學(xué)活性的片段。一般情況下,所希望測定的是具有生物學(xué)活性的成分,但有時(shí)為了某些特定的臨床目的,則需要有特異的試驗來(lái)測定降解產(chǎn)物,如hCG的核心成分。因此,為保證測定的特異性,就不僅要求有具有生物學(xué)活性的激索標準晶,而且要有臨床上相關(guān)的降解產(chǎn)物的標準品。
某些血清蛋白有在等電點(diǎn)上不同(如。1―抗胰蛋白酶)或聚合程度不同(如觸珠蛋白)的各種遺傳變異體,盡管這些變異體的比例不同會(huì )影響其免疫測定的結果,但這并不是血清蛋白免疫測定的突出問(wèn)題。用于血漿蛋白測定的試驗通常使用多克隆抗血清,多克隆抗體測定不了蛋白結構上的微小差異。相反,使用單克隆抗體則有可能測不到某些變異體,這是血清蛋白免疫測定上的一個(gè)普遍問(wèn)題糖蛋白的不均一性主要在于糖基化尤其是唾液酸含量的差異,唾液酸含量上的差異進(jìn)而引起蛋白等電點(diǎn)和電泳移動(dòng)性的差異??贵w通常對這些差異不敏感,因此,糖的不均一性對免疫反應性影響很小。然而蛋白上的糖鏈可通過(guò)修飾或覆蓋一個(gè)肽決定基而改變蛋白的免疫反應性。相反,黏蛋白的主要抗原決定基則由糖成分所組成。免疫測定實(shí)驗設計上小的差異也會(huì )引起多態(tài)性抗原測定結果上較大的差異,黏蛋白抗原CA125,CA19―9和CA15―3的測定可以很明確的證明這一點(diǎn)。例如,由不同組織產(chǎn)生的CA15―3含有不同數量的20個(gè)氨基酸的串聯(lián)重復序列,而試驗中測定抗原所用的單抗是用腫瘤細胞制備的,因而所測定的抗原是結構不太明確的大分子。盡管大多數試劑廠(chǎng)家均使用相同的標準品和抗體,但其相互之間的相關(guān)性很差,這很可能是由于在實(shí)驗設計上的差異所致,因此每一種方法都應有各自的參考范圍值。
(三)實(shí)驗設計
免疫測定的實(shí)驗設計主要涉及到抗體或抗原的使用濃度、溫育溫度、溫育時(shí)間、測定模式是采用競爭抑制或雙夾心直接測定,以及雙夾心測定是采用一步還是兩步法等,其對測定的影響主要是試驗的測定下限、特異性核簡(jiǎn)便性等。一般來(lái)說(shuō),較高的抗體或抗原反應濃度、較高的溫育溫度(如37~C而非室溫下)、較長(cháng)的溫育時(shí)間可以改善免疫試驗的測定下限,但這一切又只是相對的,還要從試劑的實(shí)際應用著(zhù)想,進(jìn)行合理的優(yōu)化。雙抗夾心酶免疫試劑由于其簡(jiǎn)單方便,又具有較好的測定下限和特異性,在大多數蛋白激索和腫瘤標志物的測定上,現已基本上取代了放免競爭抑制試驗。雙抗夾心測定模式以?xún)刹椒ㄟM(jìn)行(即臨床樣本與酶標抗體分兩步加入),可避免許多用一步法時(shí)可能會(huì )出現的問(wèn)題,如與標記抗體可能發(fā)生交叉反應但與固相捕獲抗體無(wú)交叉反應的物質(zhì)可在*步溫育后的洗滌步驟中去除;又如一步法常出現的“鉤狀”效應(即抗原濃度很高時(shí)反應顯色反而很淺,表現為測假陽(yáng)性)使用兩步法就可以避免。但由于兩步法所需測定時(shí)間相對要長(cháng)一些,因此目前在臨床實(shí)驗中使用較多的是一步法。此外,當所測物質(zhì)分子大小不一致時(shí),大分子的反應通常較小分子要慢,如溫育時(shí)間短,也會(huì )造成測定偏差。例如,在測定復合的前列腺特異抗原(PSA)(Mr90Kd)時(shí),如使用較短的溫育時(shí)間,與游離PSA相比,其結果將偏低。
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